使用线性聚乙胺的哺乳动物细胞的转染是产生重组腺相关病毒载体的简单有效方法

前言

     我们开发了一个简单的协议，使用线性聚乙胺（PEI）转染哺乳动物细胞。我们的线性PEI协议在HeLa细胞和XDC293细胞的转染中与商用试剂一样有效，HEK293细胞的衍生物，但成本仅为一小部分。超过90%的XXC293细胞和98%的HeLa细胞使用我们的方法转染，对由流细胞计确定的EGFP表达呈阳性。我们的协议应该适用于许多不同的应用，如大规模生产重组蛋白和病毒，这需要大规模哺乳动物细胞的短暂转染。我们利用该协议在XDC293细胞中产生重组腺相关病毒（AAV），在HLa细胞中产生一个d。这需要三种腺病毒基因产品（E2A、E4orf6和VA RNA）以及AAV复制（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和帽（VP1、VP2和VP3）蛋白质的瞬态表达。通过定量PCR和HeLa细胞的转导评估了一种重组AAV，即express的绿色荧光蛋白。线性PEI是一种比磷酸钙更好的转染试剂，用于在HEK293和HeLa细胞中生产重组AAV。此外，当HeLa和XDC293细胞都采用我们的方法时，在没有E1A的情况下，HeLa细胞产生的重组AAV比XDC293细胞多三倍，而XDC293细胞在构成上可以表达E1A。由埃尔塞维尔B.V.出版.

1.介绍

聚乙胺胺（PEI）已被用于转染细胞培养和体内的各种细胞类型。PEI有分枝形式和线性形式。最初，PEI的长分枝聚合物（800kDa均值分子量）用于转染哺乳动物细胞（Bousifet等人，1995年）。然而，低分子量线性PEI（25kDa）是一种更好的转染试剂，由于它在血清等生理流体中的稳定性，其细胞毒性相对较低，因此作为非病毒基因转移试剂具有特别的兴趣。线性PEI已用于在体内转染数字组织，包括肺、肝和中枢神经系统（古拉等人，1998年a;;古拉等人et，1998年b）。. 在几乎所有使用线性PEI的已发布报告中，PEI仅来自两个商业来源：ExGen 500（MBI 发酵）和 JetPEI（Qbiogene）。由于PEI的这些商业制备成分的组成是专有信息，而且由于成本相对较高，我们开发了我们自己的协议。

PEI每单体子单位含有一个氮气。这些硝基基因与核酸的磷酸盐骨干形成离子相互作用。Th erefore、DNA和PEI形成紧凑的复合丛（即多丛），大小范围从50到>1000 nm，具体取决于PEI是分枝还是线性的，以及复合物是在氯化钠还是葡萄糖中形成的（Goula   等人，1998b;怀特曼等人，2001年）。线性PEI+DNA聚物在葡萄糖存在的情况下形成约100nm颗粒，但在氯化钠存在的情况下形成较大的聚集体。

这些较大的聚合导致细胞培养的转导效率更高，但在体内表现不如。.复合物的大小也取决于PEI与DNA的比例（Goula等人)al.,，1998b）。.这通常被称为氮磷比（N/P）。

最佳基因表达需要超过PEI，而不是凝结DNA所需的多。Boeckle等人（2004年）从自由线性PEI（BoeckleBoeckle et等人，2004年）中脱皮DNA-PEI多面体。.这些纯化的多面体在转染细胞方面效果明显降低。将自由PEI添加回DNA-PEI多面体可减除了此缺陷。PEI-DNA多面体被吸收到细胞中，在内源体和糖体中et运输（Breunig等人，2005年;梅尔丹等人，2002年）。过量的PEI可能帮助DNA从内生体中逃脱。由于PEI中的胺含量高，它增加了内膜中的离子强度（例如质子海绵效应），导致内分体膨胀和中断，由于渗透压力或通过带正电荷的PEI粒子排斥囊泡膜（Merdanet等人，2002年;索纳瓦内等人，2003年）。这使得DNA逃到细胞质。梅尔丹等人followedet al.（2002年）通过延时摄影（Merdan等人，2002年）在模仿PEI之后，跟踪了个体内佐体的命运。（通常，每个细胞只有一到两个内佐体在头4小时爆发。在一些细胞中，内佐体在将线性PEI-DNA多丛添加到培养基后，早在20分钟内就被破坏。在其他细胞中，多面体从内相体逃逸到细胞质中需要3~4小时。B牧场PEI-DNA多面体比线性PEI快得多，在将多面体添加到培养基中数小时后，在内佐体中仍然存在。虽然分枝PEI和线性PEI是非常相似的化学结构，但它们的缓冲能力不同。分支PEI中的胺组是初级胺、次胺和三级胺的混合物，而在线性PEI中，胺是完全次要的。过量的PEI也会干扰内分理的正常酸化，并可能导致细胞毒性效应。

大多数PEI-DNA多面体在细胞质中去凝结，大概因为它们与多离子（如mRNA、磷酸酰植物素或青氧核糖核酸）相互作用。线性PEI-DNA复合物在应用到细胞后4小时就从细胞质中的内生体和电子凝结物中逸出et（Itakae-condense in the cytoplasm as early as 4 h after application to the cells (等人，2004年）。细胞质中的脱压缩DNA量在24小时后继续增加。然而，即使在24小时之后，大多数分枝PEI-DNA复合物仍然处于内源体中的凝结状态。

DNA如何进入细胞核目前还不清楚。一些PEI-DNA复合物在原子核中被完整地观察到，但这些多丛是否进入原子核是未知的。在分层体体中，核膜破裂，大型复合物可能进入核。 Brunneret等人（2002年）observed观察到，当细胞处于G1时，线性PEI-DNActed复合物转导的HLa细胞比细胞周期的G2/S阶段要少10倍（Brunneret等人，2002年）。这表明，通过分位体循环的细胞更有可能在细胞核中感染DNA并表达基因产品。分支PEI或脂氨基胺更依赖于状态.

2.材料和方法

2.1.细胞培养

XDC293细胞来自HEK293细胞的亚组（北卡罗来纳大学J. Samulski），该细胞比原始的HEK293细胞（美国类型培养集合 （ATCC）CRL-1573）更高效，通过调整ng◦它们在Dulbecco的修改鹰介质2C in 5% CO（DMEM;内维特罗根目录号11965-092）康泰宁5%小牛血清（内维特罗根），而不是DMEM加上10%胎儿小牛血清。HeLa细胞也从ATCC（#CCL-2） 购买，并适应在含有5% c alf血清的DMEM中生长。此处描述的实验中使用的所有细胞在DMEM中的5% CO2中以37~C传播（高葡萄糖（4.5 g/l）、L-L谷氨酰胺、和盐酸二苯二甲酸酯）和补充5%的小牛血清，链霉素（100毫克/升），五氯苯丙胺（62.8毫克/升），额外的L-谷氨酰胺（292毫克/升）和NaCl（180毫克/升）。

2.2.准备爱德华王子岛股票解决方案

线性PEI以三种不同的分子量从聚理斯公司购买：250，000、25，000和2500 Da。为了根据单体r单位（7.5 mM单体） 制造PEI溶液，线性PEI（0.323 g/l）被添加到去离子H2O中，并在低热下搅拌约1小时，直到所有粒子都加入溶液中。然后，使用去离子H 22O调整体积。大型PEI库存溶液在使用时，在±20°C下冷冻并储存在−C. Aliquots of linear PEI were thawed and stored at 44°C。线性PEI（25，000 Da）的等分调整为pH 7.0和8.0，9.0用于测试PEI溶液pH值对XDC293和HLa细胞转染的影响。pH 8.0（25，000 Da） 的线性PEI在+80° −C下冻结10分钟，然后在37° C下解冻10分钟至8次，以调查冻融对HeLa细胞转液的影响。为了与商业来源进行比较，7.5 mM林耳PEI（Qbiogene）与DNA混合，使氮/磷比为5和10。高摩尔-拉重量（250，000和25，000 Da），无水，分枝PEI（西格玛-奥尔德里希）也被用来比较转染能力。为线性PEI准备了分枝PEI（7.5 mM）的库存溶液。

2.3. CATE转染协议

XDC293细胞在6孔板（康宁）中播种，在2ml  DMEM +5%小牛血清中，在37°C，5%CO ◦C, 5% CO2.质粒pEGFP-N1（克隆技术;0.5 pmol/well;l.56米g/well）或pUC19（0.5 pmol/well;1.75米g/井）是添加到120 ml的CaTE（300 mM CaCl2，1 mM Tris+HCl pH 8，0.1 mM EDTA）溶液tha t是前一天制作的。所有转染混合物都调整为3米g/井总DNA与声波鲑鱼精子DNA。新制造的2×  HeBS pH 7.05（280 mM NaCl，50 mM HEPES，1.50 mM Na2HPO4  pH7） 被添加到CaTE/质粒混合物中，并在室温下孵育fo r15分钟，直到沉淀形成。降水后，每井加入2°10（240 ml），在37°C下孵育6小时。之后，从每个井中去除介质，新鲜DMEM = 5%的小牛血清（通常为2毫升，但一些实验1.5毫升）被添加到每个井之前，在37°C◦的额外孵育36~42小时。为了测试2×HeBS溶液的pH×值效果，pH值在7.0和7.20之间以0.05的增量进行了修改。在此实验中，使用CaCl  2对CaTE解决方案进行了预分析。2H2O纯度为99%（西格玛+奥尔德里希目录号C3306）。在另一项实验中，使用两种纯度为97%的无水氯化钙来源测试了氯化钙中的杂质效应（Fisher Acros目录号349610250;西格玛·奥尔德里希目录号383155）。在加法中，以99.99%纯度（西格玛-奥尔德里希目录号499609）在密封小瓶中购买了超纯无水氯化钙。小瓶在转染前一天打开，用来准备小瓶溶液。为了限制任何额外的不粘度，瓶子用半膜密封，并在室温下储存。还对三个HEPES来源进行了测试。效果最好的是费舍尔杂技（目录号17257-0250）。我们在这里描述的所有实验中都使用了HEPES。

2.4.利波菲明PLUS试剂协议

XDC293细胞在6孔板中播种，在2~105个细胞/孔中，含有5%的小牛血清，在37°C下48◦小时，5% CO2. pEGFP-N1（0.5 pmol/well; l.56 mg/well） 和鲑鱼精子DNA， 足以使总DNA/井达到2 mg， 在无血清介质（125  ml/well） 中稀释， 之后添加PLUS试剂 （20 ml/well） × 。利波费克-塔明（Invitrogen;1 ml/0.4  mdna）被添加到无血清介质（125 ml/well）中，然后与PLUS试剂/质粒DNA复合物结合。在室温下孵育15分钟，可以形成复合物。在此期间，每井中用含血清介质交换无血清介质。DNA/PLUS/脂质胺试剂复合物在37~C孵育前被◦添加到每个无血清培养基中，为5%CO2。介质在转染后3小时被吸走，并添加了含有5%小腿血清的新DMEM，并在37+C下孵育细胞，再孵育45小时。

2.5.转染测试PEI协议参数

HeLa和XDC293细胞在2 ml DMEM中播种，在2 ×  105细胞/井中，在6井盘中含有5%的小牛血清，在37°  ◦C下孵育48小时。从pEGFP-N1（0.5 pmol/well;l.56 mg/well）的GFP表达用于指示转染细胞，而pUC19（0.5pmol/well;1.75米g/井）用作负对对。计算质粒/井的量后，

2.6. DNA计算

质粒分子量（克/摩尔）	PMW  =（XX，bp）（650 g/mol）/1 bp
质粒DNA（米克/井）	D（米g/well）=（YY，pmol/well） （PPMW，
	g/mol）（106米克/1克）（1摩尔/1012  pmol）
三文鱼精子mDNA（米克/井）	S（mg/well）=  T （mg/well）  =  D
	（米克/井）

 

其中PMW：质粒的分子量（g/mol）， X：大小

碱质对中的质粒，Y：所需的质粒量

DNA（pmol/well），D：质粒DNA（mg/well）， T：总DNA

（米g/well）和S：鲑鱼精子DNA（米/井）的量。

2.7.爱德华王子岛计算

PEI/well的量是根据后续方程计算的。

（TT  ， mg总DNA/井）

（3 nmolP/mg Dna） （R）

爱德华（μl/井） |

 

7.5 nmol N/ml

其中T表示每井使用的总DNA，3nmol P/mmg代表对DNA的磷含量进行重制，7.5 nmol/ml是库存溶液中PEI单体的氮含量，R表示PEI氮与DNA磷的比例（例如N/P = 20）。

质粒和阿尔蒙精子DNA与150mM NaCl（100 m l/井）混合。线性PEI也添加到150 mM NaCl（100 ml/well），除了在一个实验中，涉及用5%的葡萄糖（99.5%纯度，西格玛-奥尔德里希）取代NaCl。林耳PEI/NaCl和质粒/NaCl混合土块混合在一起，短暂涡旋，在室温下孵育10-15分钟，使DNA/PEI复合物形成。这种混合（200 ml/井）直接添加到每个井的培养介质（2毫升/井）。转染后，细胞在37+C时孵育为48◦小时。

2.8.转染效率评估

使用配备CCD冷却摄像机（SPOT摄像机、诊断仪器、C.）或流式细胞仪的倒置荧光显微镜（奥林巴斯CK40）评估转染效率。为了避免在选择要拍摄的区域时出现偏差，选择了一个代表性的井区，并使用相对比显微镜进行拍摄。然后，通过暴露同一区域的EGFP阳性细胞，对它们进行紫外线照射，对荧光细胞进行磷图。通常每井拍摄3~4张图像（荧光和相位对比）。给定实验中的所有荧光图像都是在相同的曝光时间和设置下拍摄的。图像被调整u唱Spot v3.5.6软件， 以提高Egfp荧光。负对控是马尼普晚用同样的方式，以确保背景荧光

不计为正数。首先在相位对比度图像上放置一个矩形，并计算矩形内的单元格总数。然后在荧光图像上放置了具有相同尺寸的矩形。矩形设置为与相位对比度图像上完全相同的位置，并计算表示EGFP的单元格数。然后计算表达EGFP的细胞的集中度。

在一些实验中（图8和图9），EGFP表达细胞的百分比是使用FACScan流细胞仪（贝克顿·迪金森生物科学）确定的。此测定比荧光微范围测定敏感约45%。细胞被消化与三普辛（1.25毫克/毫升）在1毫升的同位素缓冲称为宇宙（136.9 mM NaCl，4.23 mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4，2.68 mM KCl，0.54 mM EDTA; pH 7.3） 根据需要，以f ew秒或分钟为单位，将团块减少为主要为单个细胞。然后，1毫升甲状甲醛（4%）在PBS中添加以修复单元格。初步实验表明，将细胞固定在甲醛中不会对GP荧光产生负面影响。细胞通过70米尼龙细胞过滤器（BD猎鹰，编号352350）之前，与流式细胞仪排序。流式细胞仪是使用卡利布里特珠子和自动计算软件（贝克顿·迪金森生物科学）校准的。使用Cell Quest版本3.3软件对数据进行了分析。FL1通道 （GFP） 的采集设置进行了调整，超过99.99%的未处理对照细胞的氟光重强度小于10。t他控制细胞的中值强度约为1.0。为了进行比较，荧光强度为10或10个的细胞被评分为阳性。

2.9.重组AAV向量pGET-GFP的克隆

质粒pGET-GFP在两个AAV端子重复之间包含EGFP表达盒（图9A）。EGFP expres-sion由CAG促进器驱动，这是CMV增强剂和鸡肉 bb-actin最小亲moter的组合。EGFP ORF的上游是一个小的内子。EGFP mRNA是多面体在兔子 b-球蛋白基因的位点。聚亚化基站点的下游是与lambda序列中的基派21905–23942对应的lambda DNA（新英格兰生物实验室）的分流（Genbank编号J02459）。lambda DNA充当一个馅料碎片，使重组病毒4736核苷酸长， 这是类似于野生型AAV.重组的AV基因组应该是3.5至4.7 kb之间，以最佳的病毒生产（图利斯和谢克，2000年）。这种质粒使用标准分子生物学技术在多个步骤中重组。此质粒的顺序可应要求提供。

2.10.重组AAV生产

重组AAV的生产需要转染三个质粒的细胞。第一个质粒，pGET-GFP，包含一个表示EGFP的重组AAV向量。第二个普拉斯中间，pAd8（萨穆斯基等人，1987，1989）表示AAV

对转导测定中使用的井的nal转染。使用此协议，误报在我们分析的样本中没有任何问题。

2.12.统计

这里报告的所有数据都是至少三个独立的实验汇编。使用Microsoft Excel 2000计算标准偏差和置信度。置信度限制在90%置信水平（+=0.1）下，使用人口的标准偏差计算。.如果Q的绝对值大于或等于0.93，Q则从数据集中排除异常值（Q-test为90%置信水平），或者四个复制的0.76。  Q 的计算方式如下：

Q =  V出 =  V附近

 

V出 =  V远

其中Vout是异常值的值，V  V靠近最近邻域的值，而V远是离外值最远的值。如果Q的绝对值大于或等于三个复制的 0.93或四个复制的0.76，则排除异常值。

3.结果

3.1.磷酸钙法的变异性y

重组AAV通常是使用磷酸钙方法对HEK293细胞进行瞬态转液产生的，因为这种方法非常成熟，而且试剂价格低廉。基本协议上有数百个var iations，然而它们都涉及在氯化钙和HEPES缓冲盐水的混合物中沉淀质粒DNA。HEK293细胞通常用于，因为它们表达两种高效AAV复制所需的甲状非病毒蛋白（E1A和E1B）。此外，HEK293细胞通过磷酸钙方法相对良好转染= 10-40%，具体取决于使用何K293细胞的类型（G.T.，未发布的数据）。我们通常使用一种称为XXXC293 ce lls的HEK293细胞的衍生物，该衍生物已被调整为在含有小牛血清的DMEM中生长 （5%）而不是胎儿小牛血清（10%）。由于不清楚的原因，XDC293细胞产生的重组AAV比亲的HEK293细胞多大约200倍——尽管它们比HEK293细胞（在新闻中）的转出效率略高。HeLa细胞通常比XXC293细胞（印刷机中的梅金尼斯）产生更多的重组AV，然而它们通过磷酸钙方法的转染效果较低。

因此，我们优化了这两种细胞类型的转染。为了标准化我们的测定，我们在六孔板上使用GFP表达质粒，pEGFP-N1，每口井0.5 pmol（1.54米g）。总DNA浓度调整为3米g/well与鲑鱼精子DNA（使用脂氨酰胺除外）。之所以选择此数量，是因为它与重组AAV生产期间使用的三个质粒的总量相似。

我们观察到通过磷酸钙方法转染XDXC293细胞的变异性很大。

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