一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备方法与应用

[0001] 本发明属于生物技术制药领域，特别涉及一种敲除GS基因的CHO细胞株及其制备 方法与应用。 背景技术

[0002] 中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells ,CHO)是目前广泛使用的哺乳 动物表达宿主细胞，它属于成纤维细胞，既可以贴壁生长，也可以驯化成悬浮生长，悬浮生 长的CHO细胞可以进行高密度发酵培养，适合大规模生产重组蛋白药物。与其他重组蛋白表 达宿主相比，CHO细胞有着其无可代替的优势：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达产物与 其天然蛋白分子在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近，尤其适用于复杂大分子 蛋白药物表达；(2)可以进行高密度发酵培养，有较高的剪切力和渗透压抵抗能力；(3)外源 基因分子可以实现高拷贝表达，外源表达蛋白产量较高及相对稳定；(4)外源产物一般属于 分泌表达，且较少存在内源性蛋白的干扰，利于后续分离纯化；(5)细胞背景清楚，应用较成 熟，很容易实现大规模生产。以 C HO细胞为宿主的药物表达系统中，二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolate reductase ,DHFR)和谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase ,GS)为最广 泛使用的两个筛选表达系统，而GS系统因为其筛选出的细胞株产量高和靶基因整合更稳 定，工业上应用越来越普及。 

[0003] GS是合成L-谷氨酰胺的关键酶，缺失GS的细胞自身无法合成L-谷氨酰胺，从而必 须依赖外界环境提供L-谷氨酰胺才能生存。传统的GS系统是通过在无L-谷氨酰胺的培养基 中同时加入GS抑制剂MSX进行高产细胞株筛选，只有表达足够多GS的细胞才能在高浓度的 MSX条件下存活下来。然而，按照传统的方式进行细胞株筛选，细胞筛选周期较长，效率较 低，得到的细胞株产量也相对较低。因为CHO细胞内源性GS基因对细胞筛选过程存在较大的 干扰，目的蛋白基因和GS基因整合拷贝数低的细胞也能在加压条件下存活下来，增加了筛 选出目的蛋白高表达细胞株的难度，同时较高浓度的MSX压力也不利于CHO细胞正常生长及 分泌表达外源蛋白。因此，降低CHO细胞内源性的GS表达是改善GS筛选表达系统的一种重要 途径，其中获得GS基因缺陷的CHO细胞就是较为理想的一种方式。 

[0004] GS基因缺陷的细胞(GS-/-)自身无L-无谷氨酰胺合成酶功能，必须严格依赖于外 源提供的L-谷氨酰胺才能存活。GS-/-细胞转染后置于无L-谷氨酰胺培养基中即可完成筛 选过程。只有整合入外源GS基因且整合位点在基因组内转录活跃区域的细胞才能存活下 来，未整合外源GS基因或整合的GS外源基因表达量低的GS-/-细胞无法在无L-谷氨酰胺培 养基中存活。一般而言，目的蛋白基因在GS基因上游或下游，因此可以通过这个系统，在不 添加MSX的情况下，快速筛选到GS和目的蛋白表达量较高的细胞株。 

[0005] CRISPR/Cas9基因编辑是目前操作最简便高效的基因编辑方式，只需要通过特异 性的sgRNA序列碱基互补定位结合到基因组上相应的靶序列，sgRNA引导的Cas9酶就可切割 DNA双链导致双链断裂(Double strand break ,DSB)，断裂后的DNA通常会通过非同源末端 连接(non-homologous end joining ,NHEJ)的方式进行修复。NHEJ修复的准确性和频率都 较低，修复后很可能会造成DSB处小片段发生碱基突变、碱基插入或者碱基缺失，导致基因 发生突变或移码，表达的蛋白因结构改变或者序列不完整而失去正常功能，从而实现靶基 因修饰。 

[0006] CRISPR/Cas9表达载体转染入细胞中进行基因编辑的同时，表达载体的序列可能 会整合入细胞基因组中，破坏基因组的完整性。目前，未见有关于CRISPR载体整合入宿主细 胞基因组序列的鉴定的相关报道，这些含有整合载体序列的细胞株可能会表达嘌呤霉素抗 性基因，可能会持续表达Cas9蛋白和sgRNA序列，造成细胞基因组的切割损伤，同时消耗细 胞资源，增加细胞株代谢负担。载体序列随机整合入宿主细胞基因组后，有增加激活癌基因 的可能性，造成细胞株癌变，癌变细胞不适宜生物制品的表达。因此，在制备敲除GS基因的 CHO细胞株须鉴定并去除含有整合载体序列如嘌呤霉素抗性基因、Cas9基因、sgRNA等的细 胞株。

[0007] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种敲除GS基因的CHO 细胞株。这是一种无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。

[0008] 本发明的另一目的在于提供上述的敲除G S基因的CHO细胞株的制备方法。这是一 种基于CRISPR/Cas9技术实现CHO细胞GS基因敲除，尤其是一种无嘌呤霉素抗性、无Cas9基 因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株分离、鉴定的方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因编 辑系统可以敲除CHO细胞的GS基因，筛选出三株两个GS等位基因均有碱基突变、插入或缺 失，GS基因敲除且无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞。

[0009] 本发明的再一目的在于提供上述的敲除GS基因的CHO细胞株的应用。应用CHO GS-/-细胞构建筛选目的蛋白表达量高的单克隆细胞株。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现： 

[0011] 一种敲除GS基因的CHO细胞株(CHO GS-/-)，其无GS蛋白表达且无嘌呤霉素抗性、 无Cas9基因及sgRNA序列整合入细胞基因组中。

[0012] 所述的敲除GS基因的CHO细胞株，优选为细胞株A、细胞株B或细胞株C；更优选为细 胞株B；其中：

[0013] 细胞株A的GS基因编码区外显子6的核苷酸序列如下所示：一个等位基因的序列如 SEQ ID NO .22所示，另一个等位基因的序列如SEQ ID NO .23所示； 

[0014] 细胞株B的GS基因编码区外显子6的核苷酸序列如下所示：两个等位基因的序列如 SEQ ID NO .24所示；

 [0015] 细胞株C的GS基因编码区外显子2的核苷酸序列如下所示：一个等位基因的序列如 SEQ ID NO .25所示，另一个等位基因的序列如SEQ ID NO .26所示。 

[0016] 一种敲除GS基因的CHO细胞株(CHO GS-/-)的制备方法，包括如下步骤： 

[0017] (1)针对CHO细胞GS基因的编码序列(CDS)，设计合成得到内切酶Cas9引导序列 sgRNA；

[0018] (2)将步骤(1)得到的sgRNA克隆至基因编辑载体(该载体表达内切酶Cas9)中，得 到同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体；

[0019] (3)将同时表达sgRNA和内切酶Cas9的基因编辑载体转染CHO细胞，加入嘌呤霉素.

进行筛选；

[0020] (4)将存活的细胞进行分离，获得单克隆细胞，静置培养，得到单克隆细胞株；

[0021] (5)将扩大培养的单克隆细胞株进行GS缺陷功能鉴定：将同一株单克隆细胞株中 的一部分置于含有L-谷氨酰胺的培养基中培养，将一部分置于不含有L-谷氨酰胺的培养基 中培养；在含有L-谷氨酰胺的培养基中能存活，但在不含L-谷氨酰胺的培养基中不能存活 的细胞株，即为GS功能缺陷的CHO细胞株，简称为CHO GS-/-细胞株； 

[0022] (6)将得到的CHO GS-/-细胞株进一步筛选获得无嘌呤霉素抗性、无Cas9基因及 sgRNA序列整合的CHO GS-/-细胞株。      [0023] 步骤(6)的具体操作优选为：

[0024] (A)将同一株CHO GS-/-单克隆细胞株分别置于含有嘌呤霉素和不含嘌呤霉素的 培养基中培养；在含有嘌呤霉素的培养基中不能存活的细胞株，即为不含嘌呤霉素抗性的 CHO GS-/-单克隆细胞株；

[0025] (B)提取CHO GS-/-单克隆细胞株基因组DNA，PCR扩增Cas9基因序列和sgRNA序列， 分析扩增产物；无法扩增出理论长度片段的细胞株，即为无Cas9基因及sgRNA序列整合的 CHO GS-/-细胞株；

[0026] 将步骤(A)和(B)的结果结合起来，筛选到不含嘌呤霉素抗性，无Cas9基因及sgRNA 序列整合的CHO GS-/-细胞株。 

[0027] 步骤(1)中所述的sgRNA为特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA和特异性靶向GS 基因第六外显子的sgRNA中的一种或两种。

[0028] 所述的特异性靶向GS基因第二外显子的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .7所示。

[0029] 所述的特异性靶向GS基因第六外显子的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示。 

[0030] 步骤 (2)中所述的基因编辑载体包括但不限于 l e n t i C R I S P R v 2、P X 4 5 9和 LentiCrispr-E。

[0031] 步骤(3)中所述的CHO细胞包括但不限于CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株。

[0032] 步骤(3)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法 和磷酸钙转染法。 [0033] 步骤(3)中所述的CHO细胞在转染前先进行活化，调整到对数生长期再进行转染。

[0034] 所述的活化的培养基优选为含谷氨酰胺的CD培养基。

[0035] 所述的谷氨酰胺在所述的活化的培养基中的浓度为8mM。

[0036] 所述的CD培养基优选为CD FortiCHO(Thermo Scientific)培养基、CD OptiCHO培 养基(Thermo Scientific)或CD M4CHO培养基(Hyclone)。 

[0037] 步骤(3)中所述的加入嘌呤霉素的时间优选为转染后24～72小时；更优选为48小 时。

[0038] 步骤(3)中所述的筛选的条件优选为：嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的 终浓度为2～7 .5μg/ml计，筛选时间为3～5天。

[0039] 步骤(4)中所述的分离的方法包括但不限于有限稀释法、流式分选法和半固体培 养基分离法。

[0040] 所述的有限稀释法中的铺板细胞密度优选为0 .3～0 .5个细胞/孔。

[0041] 步骤(4)中所述的静置培养的时间优选为12～14天。 

[0042] 步骤(5)中所述的培养基优选为CD培养基。

[0043] 所述的CD培养基优选为CD FortiCHO(Thermo Scientific)培养基、CD OptiCHO培 养基(Thermo Scientific)或CD M4CHO培养基(Hyclone)。

[0044] 步骤(5)中所述的L-谷氨酰胺的用量按其在培养基中的浓度为8mM。

[0045] 步骤(6)(A)中所述的培养基优选为CD培养基。

[0046] 所述的CD培养基优选为CD FortiCHO(Thermo Scientific)培养基、CD OptiCHO培 养基(Thermo Scientific)或CD M4CHO培养基(Hyclone)。

[0047] 步骤(6) (A)中所述的嘌呤霉素的用量按其在细胞培养体系中的终浓度为2μg/ml 计。

[0048] 步骤(6)(A)中所述的培养的时间为7天。

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