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贴壁细胞转染步骤(24孔板)参考
转染前一天(20-24小时), 将胰酶消化后的细胞按照每孔0.5-2×105个细胞的量进行铺板, 使其在转染时密度为90~%。转染前,试剂及培养基置于室温30min或水浴预热。
(1) 对于每孔细胞,使用50 μL无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ 培养基) 稀释0.5 μg DNA, 混匀。
(2) 对于每孔细胞,使用50 μL无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.6-2.5 μL PEIMAX-40k转染试剂,室温孵育5 min,注意孵育时间不要过长。
(3) 将稀释好的78PEI40000转染试剂加入到稀释的质粒中(总体积100 µL) 轻轻混匀,注意顺序:转染试剂加入质粒中,不要粘在壁上。 随后在室温(15-25℃) 孵育20-30 min, 使得DNA-PEIMAX复合物形成。
(4)直接将100µL DNA-78PEI40000复合物滴加到细胞培养板每个孔中,轻轻摇动培养板混匀。
(5) 37℃, 5% CO2培养箱培养12-24h后, 可观察荧光标记物表达或转基因表达分析, 根据实验需要更换培养基及培养时间。
注意事项:
- 转染试剂要求细胞铺板密度较高, 以90%-95%为佳, 这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响; 如果你研究的基因要求比较长的表达时间, 可选择细胞铺板密度较低时转染。
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制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂, 因为血清会影响复合物的形成。
转染的时候培养基中不能添加抗生素。 - 使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率, 质粒中的内毒素影响转染。
- 初次使用应优化DNA浓度和PEIMAX试剂量以得到最大的转染效率。 DNA 和转染试剂的比例, 通常推荐是1:2-1:4,比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞, 使用0.5 µg DNA和1.5-2 µL转染试剂。 通过调整DNA/PEIMAX转染试剂比例优化转染效率, 一般293T 转染效率可大于90%。 调整范围DNA(μg): PEIMAX(μL) 比值在1: 0.5-1: 5。
- 不同质粒种类以及大小会影响转染效率,可如较大片段插入质粒可能转染效率低,可根据实际实验需要调整,如适当增加转染质粒总量等。
- 细胞状态及代数会较大程度影响转染。刚复苏细胞需传代2-3次以上,待细胞生长稳定后做转染实验。为保证实验稳定性,转染细胞尽量选择20代以内进行实验。
- 对于贴壁性低的细胞系,可用明胶或鼠尾胶铺板,增加细胞与培养皿之间的粘附性。
- BIOHUB品牌的转染试剂对比polysciences活性更高大约是1.5倍左右,如果过去用的是polysciences可以适当减少用量。